4.26 식중독균에 대한 분자생물학적 시험방법. 살모넬라 시험법 1) 거푸집 유전자 준비 증균 배양액(1~2mL)을 취한 후 10분간 끓여서 원심 분리하고 상등액 10~20μL을 따서 시료로 사용한다. ※ 상기 방법과 동등 이상의 유전자 추출 키트 및 장비를 사용할 수 있다. 2) Real-time PCR 프라이머 및 로브 염기서열 유전자 프라이머/프 로브 염기서열(5’→3′) invA invA-R invA-P 5′-GAATCC TTC AGTT TTC-3’5′-CGATT GCCGA AC… www.foodsafetykorea.go.kr
식품 공정에는 제8. 일반 시험 법/4. 미생물 시험 법이 있었고, 11종의 식중독 세균에 대해서 분리 배지로 분석하는 방법이 등재되고 있다.그리고 4.26에는 분자 생물학적 시험 법이 있다.이 시험 법은 분자 생물학의 방법 중 real-timePCR을 이용하는 것으로, 살모넬라와 쿠로 노박타ー 사카 자키에 대한 시험 법이 등록되어 있다.거푸집 유전자는 우선 증가 균 배양액을 잡고 10분간 삶아 원심 분리하는 boiling method이다.목적 염기 배열은 invA에 설정되어 있다.PCR반응 효소는 PowerAmpTM Real-time PCR Master Mix와 동등 이상의 시약을 사용하게 되어 있으나, 시판되는 일반 master mix을 사용해도 무난하고 있다고 생각된다.Real-timePCR반응 조건은 50℃에서 2분간 유지하고 95℃에서 10분간 방치해서 최초의 변성을 일으킨 뒤 95℃에서 15초간 변성시키고 60℃에서 1분간 유전자 결합 및 신장 반응이 일어나기를 1cycle에서 총 40cycle의 증폭 반응을 한다.결과 확인은 증폭 곡선이 확인되지 않을 경우 살모넬라를 덜 검출한다.그러나 음성 대조군에서 증폭 곡선이 나타나거나 양성 시료에서 곡선이 보이지 않을 경우에는 실험 자체에 문제가 있을 수 있으므로 다시 실험한다.또 증폭 곡선이 확인될 경우에는 균주를 분리 뒤, 생화학적 검사 등을 통하여 살모넬라로 확인되면 검출이라고 판정한다.이는 real-timePCR법을 screening방법으로 활용하겠다는 뜻이다.미국 FDA BAM에는 현재 Cronobacter의 확인인 Identification에 biochemical방법과 PCR검출 법을 모두 인정했고, 국내와는 다르다.생화학적 방법이 분자 생물학적 방법보다 specificity이 높다는 것인가?이해가 잘 안 된다.흥미롭게도, real-timePCR이후 golden rule인 biochemical방법으로 confirm을 한다고 생각하니까 시간이 거꾸로 되다….오히려 16S rRNA gene sequenicing에 의해서 confirm이라는 게 오빠는 맞겠다.
크로노박터 사카자키도 거의 비슷하게 진행하지만 증폭곡선이 확인되면 분리배양 후 생화학적 검사 등을 통해 동정하여 검출로 판정하라는 말은 없다.ㅋㅋ
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